尊龙凯时冻存原理：当细胞温度降至0°C以下时，会发生细胞脱水现象，导致细胞内可溶性物质浓度增加，同时形成冰晶。冰晶大小对细胞造成的影响大相径庭，大冰晶容易损伤细胞膜和细胞器，进而影响细胞复苏后的存活率与状态。因此，在细胞冻存过程中，我们通常采取两项重要措施：一是加入低温保护剂，二是采用慢速冷冻技术。

冻存时机：细胞应在生长良好、密度约为80-90％，数量通常为10⁶-10⁷/ml时进行冻存。活力较差的细胞在冻存后的存活率通常很低。

低温保护剂：常用的低温保护剂为二甲基亚砜（DMSO），它能迅速渗入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，减缓冻结速度。DMSO的作用在于使细胞内的水分在冻结之前排出至细胞外，并在细胞外形成冰晶，从而减少细胞内冰晶的生成，降低对细胞的损伤。

慢冻细胞：为避免细胞内产生大型冰晶，可以使用程序降温盒实现缓慢冷冻。如果没有降温盒，可以将细胞按顺序放置在4°C 1小时、-20°C 2小时，以及-80°C过夜，绝大部分细胞能够适应这一过程。

冻存液配置：冻存液需提前配制并室温保存，以防临时配制产生的热量损伤细胞（DMSO与培养基结合时会释放热量）。常规冻存液的配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1。如细胞较为珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

操作步骤：

1. 使用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗涤1-2遍；

2. 消化细胞：加入适量胰酶，置于37°C培养箱中消化（在10厘米培养皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化时间为4-5分钟，注意不同细胞消化时间可能不同，消化终止应观察到80%-90%以上的细胞变圆）；

3. 消化结束后，加入2倍体积的完全培养基以终止消化，并进行800-1000rpm离心3-5分钟；

4. 准备好冻存管，标记日期、细胞类型、操作者姓名及代数，待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，每管1-1.5ml后转移到冻存管中；

5. 将冻存管放入程序降温盒中，置于-80°C过夜，随后转移至液氮中保存。

注意事项：

1. 细胞加入冻存液后应立即放入-80°C保存，避免常温放置时间过长；

2. 冻存细胞在-80°C中储存通常不建议超过半年，而在液氮中的存储时间建议不超过2年。

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